黄芪甲苷（astragalosideIV，AS-IV）是黄芪中含量最高、活性较为广泛的有效成分。国内外研究证实黄芪具有保护肾脏、治疗慢性肾脏病的作用[1-3]，故AS-IV也被广泛用于慢性肾脏疾病的治疗。慢性肾脏疾病以蛋白尿产生、足细胞缺失、肾小管萎缩和间质纤维化为特征，蛋白尿通过诱导炎症反应、肾小管细胞凋亡和间质纤维化引起肾损伤[4-5]。慢性肾病的常规治疗包括给予激素、免疫抑制剂或血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）/血管紧张素受体阻滞剂（ARB）类药物，但并没有显示出防止足细胞和肾小管细胞凋亡、抑制肾脏纤维化的优势。故越来越多的研究者开始寻求中药治疗方案，以弥补肾病常规治疗的不足。诸多研究证实AS-IV具有抗炎[6-7]、抗凋亡[8-10]、抑制纤维化[11-14]等作用，在肾病治疗中有广泛的应用前景。本文通过综述AS-IV保护肾脏的分子机制，为该药临床研究及进一步开发利用提供依据。
1.保护足细胞
所有肾小球疾病的共同最终途径是足细胞消失、肾小球硬化[15]。足细胞是终末分化的细胞，不能依赖于新细胞的补充，其凋亡是导致数量减少的主要因素[16-18]。足细胞的凋亡和缺失导致滤过屏障结构的破坏，从而引起蛋白尿的发生。研究表明足细胞损伤和丢失是肾小球疾病包括局灶阶段性肾小球硬化、糖尿病肾病（DN）、微小病变和膜性肾小球病发生和发展的关键因素[19]。保护足细胞，抑制其凋亡可能为治疗慢性肾病提供新的方向。
1.1 上调整合素α3β1。
在蛋白尿肾病中，足细胞足突消失，进一步的损伤会造成足细胞从肾小球基底膜（GBM）脱落甚至凋亡[20]。整联蛋白和整联蛋白连接激酶（ILK）参与足细胞从GBM脱落过程，整联蛋白是细胞表面蛋白家族，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质（ECM）的黏附。整联蛋白异二聚体由α和β亚基组成，足细胞通过整合素α3β1与GBM连接，高糖（HG）可诱导足细胞整合素α3β1的减少，并伴有足细胞对GBM的黏附性降低。实验证明AS-IV能够改善链脲佐菌素（STZ）诱导的DN大鼠系膜基质扩张、肾小球硬化和间质纤维化，并以剂量依赖方式减少足细胞足突消失[21]。AS-IV通过抑制ILK，上调整合素α3β1的表达，恢复足细胞的细胞-基质黏附，减少足细胞脱落。类似的研究也证实AS-IV通过上调DN大鼠肾组织整合素β1表达，抑制ILK和α-辅肌动蛋白-4的表达，改善足细胞黏附功能[22]。
1.2 调节线粒体质量控制。
线粒体是一种动态细胞器，在能量代谢、信号转导及细胞分化、增殖和凋亡的调节中发挥着重要的作用[23]。肾脏是一种高度需氧器官，富含线粒体，而线粒体稳态通过线粒体质量控制维持，包括线粒体生物合成、线粒体融合/分裂及线粒体自噬[24]。研究显示AS-IV可显著抑制db/db糖尿病小鼠肾脏中线粒体裂变主要调节因子动力相关蛋白1（Drp-1）、裂变蛋白1（Fis-1）和线粒体分裂因子（MFF）的上调，抑制线粒体分裂[25]。PTEN诱导假定激酶1（PINK1）/Parkin介导的线粒体自噬是最著名的线粒体自噬途径。线粒体自噬能够促进线粒体更新并防止功能失调线粒体的积累，起到保护细胞的作用，但也可能导致细胞损伤[26]。研究观察到db/db小鼠肾脏线粒体中PINK1表达水平上调，其蛋白量的积累进一步将Parkin从细胞质募集到线粒体且活性增加，并在丝氨酸65（Ser65）处磷酸化 [p-Parkin （Ser65）]。而AS-IV下调了PINK1、Parkin和p-Parkin （Ser65）的异常表达[25]。提示AS-IV干预了线粒体自噬。线粒体融合蛋白1/2（Mfn-1/2）和视神经萎缩蛋白1（OPA-1）分别负责外部和内部线粒体膜融合。在该项研究中AS-IV并没有改变Mfn-1/2和OPA-1的蛋白表达量，并且对线粒体生物合成的主要调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）及其下游信号核呼吸因子-1（NRF-1）的蛋白也没有显著改变[25]。表明AS-IV没有干预db/db小鼠肾脏线粒体的融合和生物合成。以上研究表明AS-IV可以通过干预线粒体分裂和自噬恢复线粒体质量控制的失调，进而保护肾脏。
1.3 上调肌浆/内质网（ER）Ca2+-ATP酶。
ER在新合成蛋白质的折叠和加工中起重要作用，各种可以扰乱内质网稳态，导致内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白堆积的物质或细胞因子，都会引起内质网应激（ERS）。ERS时从内质网到细胞核的一系列信号传导即为未折叠蛋白反应（UPR），UPR包括3种信号途径：活化转录因子6（ATF6）途径[27]、蛋白激酶样内质网激酶（PERK）-真核翻译起始因子2α（eIF2α）-活化转录因子4（ATF4）[28]和内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（IRE1α）-X盒结合蛋白1（XBP1）途径[27,29]。ER是细胞内Ca2+的主要储存位点，并依赖腔内Ca2+浓度维持其功能。体内Ca2+平衡失调可引发ERS和UPR的激活。肌浆/ER Ca2+-ATP酶（SERCA）的功能是将Ca2+从细胞质泵入ER，维持ER内Ca2+稳态，SERCA功能障碍导致细胞质Ca2+升高并引发ERS[30]。SERCA2是SERCA家族成员之一，在代谢综合征中其活性和/或表达减少，进而导致ERS和ERS诱导的细胞凋亡[30]，其中SERCA2亚型b（SERCA2b）在肾脏和条件永生化小鼠足细胞中最常见。研究显示db/db糖尿病小鼠肾脏中ERS反应时UPR的3种信号途径被激活，ATF6、PERK、IRE1α及其下游靶标eIF2α、ATF4和XBP1被激活，并且诱导下游凋亡介质C/EBP同源蛋白（CHOP）、c-Jun-N-末端激酶（JNK）和半胱氨酸天门冬氨酸蛋白水解酶-12（caspase-12）来诱导足细胞凋亡。而AS-IV显著消除了db/db糖尿病小鼠肾脏中的ERS及其诱导的细胞凋亡，表现为对上述ERS、UPR反应分子的强烈抑制[8]。ERS对Ca2+稳态的干扰也引起线粒体介导的细胞凋亡，在db/db糖尿病小鼠肾皮质表现为促凋亡蛋白Bax、细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）、凋亡诱导因子（AIF）水平升高及抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，这与棕榈酸引起的体外培养的足细胞溶质Ca2+水平升高和线粒体凋亡途径一致[8]，而AS-IV则以剂量依赖性方式恢复基础细胞溶质Ca2+水平，同时显著抑制细胞色素C、APAF1、AIF蛋白的表达，提示AS-IV能抑制线粒体介导的足细胞凋亡途径[8]。以上研究表明AS-IV通过ERS和线粒体2个信号途径抑制足细胞凋亡，即SERCA-Ca2+-ERS-UPR和SERCA-Ca2+-ERS-线粒体途径，其能作用于这2种途径的最上游靶点，通过恢复SERCA2表达避免下游一系列级联反应的发生，但也不排除其作用于下游信号途径的某个或多个靶点。相似的研究显示AS-IV通过上调SERCA2b和AMP活化蛋白激酶α（AMPKα）表达，减弱因SERCA2b表达不足引起的ERS，以及减弱由ERS和AMPKα促进的自噬来减少足细胞凋亡[31]。另有研究证实AS-IV在STZ诱导的DN大鼠和依霉素诱导的体外足细胞中，通过抑制ERS-PERK- eIF2α-JNK信号途径来抑制足细胞凋亡[9]；以及AS-IV通过下调PERK-ATF4-CHOP信号通路抑制ERS诱导的DN大鼠足细胞凋亡[10]。
1.4 抑制TRPC6/Ca2+/CaN/NFAT信号途径。
瞬时受体电位（TRP）通道属于阳离子通道的异质超家族，参与许多生物功能调节，其中包括调节Ca2+稳态。TRP通道的刺激诱导Ca2+流入细胞并随后激活蛋白激酶[32]。瞬时受体电位通道6（TRPC6）是足细胞中主要的Ca2+内流通路[33]。TRPC6的下游信号传导包括2种钙依赖性转录因子的激活，活化T细胞核因子（NFAT）和cAMP反应元件结合蛋白[32]。NFAT是钙调神经磷酸酶（CaN）的底物，属于Ca2+依赖性转录因子。灭活细胞中NFAT高度磷酸化并位于细胞质，在去磷酸化后转移到细胞核，并在细胞核刺激基因转录。已有研究证实TRPC6/Ca2+/CaN/NFATc1信号通路参与足细胞损伤[34]。研究显示AS-IV通过抑制HG刺激的足细胞中TRPC6的上调，降低了细胞内Ca2+流入水平。在HG诱导的足细胞中活化T细胞核因子2（NFAT2，TRPC6信号传导途径的下游蛋白）上调，并在细胞核部位积累，即NFAT2出现核转位。AS-IV可抑制这一现象，降低NFAT2表达，具体表现为上调细胞质NFAT2 mRNA，下调细胞核NFAT2 mRNA[35]。另外AS-IV还抑制了足细胞Bax（细胞凋亡的指标）表达。证实AS-IV通过抑制TRPC6- Ca2+-CaN-NFAT2-Bax信号途径阻止HG诱导的足细胞凋亡[35]。
1.5 调节miR-378/TRAF5和TUG1/TRAF5信号途径。
研究表明肿瘤坏死因子受体（TNFR）相关因子5（TRAF5）介导核转录因子-κB（NF-κB）的激活，诱导小鼠足细胞凋亡[36]。微小RNA（miRs）是转录后调节基因表达的小的非编码RNA，生物信息学分析表明miR-378通过抑制TRAF5的3’-UTR活性下调TRAF5表达[37]。STZ诱导的DN大鼠及HG诱导的小鼠足细胞培养实验显示HG抑制了足细胞中miR-378的表达，并促进TRAF5 mRNA和蛋白的表达以及足细胞凋亡。AS-IV干预后上调miR-378的表达，抑制TRAF5表达，减少了足细胞凋亡[37]，提示AS-IV可能通过调节miR-378/TRAF5信号途径抑制DN大鼠足细胞凋亡。另有研究显示牛磺酸上调基因1（TUG1）表达水平在DN小鼠肾小球中持续降低，而TUG1在足细胞的特异性过表达改善了DN小鼠生化及病理学表现[38]。TUG1与TRAF5相互作用，TUG1过表达促进TRAF5蛋白的降解。AS-IV能够上调TUG1、下调TRAF5的表达水平，减少STZ诱导的DN大鼠足细胞凋亡[39]。
2.抑制肾脏纤维化
肾小管间质纤维化和肾小管萎缩在慢性肾病的发病过程中起关键作用，也是以持续性或复发性蛋白尿为特征的原发性或继发性肾病进展的主要决定因素[40-42]。蛋白尿不仅是肾小球疾病严重程度的标志，而且是肾小球和肾小管间质进一步损伤的因素。持续暴露于大量白蛋白中的近端小管由于蛋白超负荷而导致其上皮细胞凋亡，并可能导致细胞因子、趋化因子、生长因子和血管活性分子的释放增加及补体激活，诱导间质炎症细胞浸润。管状细胞分化为肌成纤维细胞，随后出现间质纤维化，并进一步引发肾单位丢失和肾功能恶化[43]。
2.1 抑制丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB信号通路。
肾间质纤维化是由慢性炎症引起的肾间质成纤维细胞增生和ECM的过度积累。ECM是由蛋白多糖和纤维蛋白如胶原蛋白、纤连蛋白和层黏连蛋白组成的动态结构。转化生长因子-β（TGF-β）通过上调基质蛋白合成和抑制基质降解在组织纤维化中发挥重要作用[44]。TGF-β信号转导涉及经典的Smad依赖途径[45]和非经典信号途径，TGF-β通过非经典途径激活MAPK家族，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、p38MAPK和c-Jun-N末端激酶（JNK）[46]。研究显示AS-IV以剂量依赖性方式抑制TGF-β1诱导的大鼠肾成纤维细胞活性增加，表现在下调细胞增殖标志物增殖细胞核抗原（PCNA）的表达；并以剂量依赖性方式抑制TGF-β1诱导的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）增多，进而抑制成纤维细胞的分化[47]。另外，AS-IV还可以通过抑制胶原蛋白Ⅰ和纤连蛋白生成抑制ECM合成[47]。进一步研究显示AS-IV能抑制TGF-β1诱导的肾成纤维细胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK的活化，并且抑制TGF-β1诱导的磷酸化IκBα上调和NF-κB p65亚基的核转位[47]。IκBα和NF-κB p65来自IKK/I-κB/ NF-κB信号途径[48-49]，IκBα是IκB的家族成员，是调控NF-κB的上游关键分子；而NF-κB p65是NF-κB的5个成员之一，对调控靶基因转录具有关键性作用[47]。以上研究结果表明，AS-IV是通过调节MAPK和NF-κB信号传导途径的活性抑制肾成纤维细胞分化和ECM形成，并且通过p38MAPK途径抑制胶原蛋白、纤连蛋白、α-SMA合成进而发挥抗纤维化作用[11-12]。
2.2 抑制TGF-β/Smad信号通路。
TGF-β受体是丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜异型Ⅰ型和Ⅱ型受体复合物，其经受体活化后通过Smad依赖性和非Smad依赖性传递信号[50]。Smad信号传导途径包括Smad2/3等分子[51]，肾脏的纤维化与Smad2/3明显升高有关。DN中肾小管上皮细胞间充质转化（EMT）为成纤维细胞，是肾纤维化过程中细胞外基质的主要来源。TGF-β/Smad信号通路激活使α-SMA蛋白表达增加[52]，α-SMA是参与肾小管上皮细胞EMT过程的间充质细胞标记物，其水平可反映肾纤维化程度。AS-IV可降低DN小鼠肾中TGF-β1、Smad2/3和α-SMA蛋白表达[13,52]，表明其通过抑制TGF-β/Smad信号通路抑制肾脏纤维化和肾小管上皮细胞EMT。
2.3 抑制TLR4/NF-кB途径。
当肾脏受到损伤时，几乎所有肾脏细胞包括成纤维细胞、肾小管上皮细胞、周细胞、内皮细胞及足细胞都会参与肾脏修复和ECM生成[53]。同时，淋巴细胞、单核/巨噬细胞和其他炎症细胞通过不同途径参与肾纤维化的异常修复，表现为炎症细胞浸润、成纤维细胞活化和增殖、ECM积聚。NF-κB是调节促炎介质产生的关键转录因子，用于确定炎症反应；促炎介质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等可诱导前馈炎症反应[54]。研究显示AS-IV能显著减低单侧输尿管梗阻（UUO）肾纤维化模型小鼠纤连蛋白和胶原蛋白Ⅰ，抑制炎性细胞浸润和炎症细胞因子分泌，表现为减少了浸润性巨噬细胞和淋巴细胞数量及炎症细胞因子TNF-α和IL-1β mRNA水平[55]。体外研究显示AS-IV抑制了脂多糖（LPS）刺激的人肾小管近段上皮细胞（HK-2细胞）中炎症细胞因子TNF-α和IL-1β mRNA水平[55]。TLR是LPS的受体之一，TLR4是TLR家族的重要成员，能诱导炎性细胞因子表达，并作为信号通路的启动子激活NF-κB，刺激促炎反应[56]。体内、体外研究显示AS-IV抑制了UUO小鼠TLR4、NF-κB表达，上调NF-κB抑制剂IκBβ表达，与TLR4抑制剂TAK-242有相似效果[55]。以上结果表明AS-IV可通过TLR4/NF-кB途径减少肾脏纤维化过程中的炎症反应，改善肾纤维化。AS-IV通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减弱炎症反应已在其他研究中得到证实[57]。
3.保护肾小管细胞
过量白蛋白通过近端小管细胞再摄取并激活一系列信号通路引起肾小管间质炎症、氧化应激、纤维化和肾小管细胞损伤和死亡[58]。因此，肾小管上皮细胞在协调蛋白尿诱导的肾损伤和纤维化进展中起重要作用。另外，肾小管细胞凋亡可能导致肾小管形态学改变，进一步导致肾小管萎缩[59]。
AS-IV可以改善顺铂诱导的HK-2细胞的毒性，改善小鼠肾小管结构损伤[60]，减少跨膜蛋白肾损伤分子-1（KIM-1）的表达。其作用机制是通过抑制NF-κB途径抑制炎症反应及通过激活Nrf2/HO-1途径抑制氧化应激，进而保护肾小管细胞。NF-κB调节并促进参与炎症过程的众多炎症介质的释放[61]。Nrf2是一种核转录因子，激活后可转位于细胞核内，诱导抗氧化蛋白类基因、抗氧化防御因子和抗炎因子类等表达，增强组织抗氧化、抗炎及抗凋亡能力[62]。HO-1是广泛存在的抗氧化防御酶，可被Nrf2调节[60]。Nrf2/HO-1途径通过诱导氧化应激参与肾小管细胞损伤并导致肾毒性[63]。而关于AS-IV的抗氧化作用以及依赖于Nrf2信号传导的激活发挥抗氧化作用在既往研究[63-64]中已经证实。
4.抑制肾小球系膜细胞活化
系膜细胞（MC）活化在许多肾纤维化相关的肾小球疾病中多有发生，MC被激活后增加α-SMA蛋白表达，进而增殖合成过量的EMC[65]，促进肾脏纤维化。AS-Ⅳ可以通过调节组蛋白去乙酰化酶1（SIRT1）/NF-κB途径、增强自噬来抑制MC活化[66]。SIRT1的功能是去除蛋白质上的乙酰基团，研究表明其通过介导Smad7去乙酰化抑制TGF-β1诱导的MC凋亡[67]。NF-κB可通过SIRT1去乙酰化调节自噬[68]。AS-Ⅳ能以剂量依赖方式降低α-SMA、纤连蛋白和胶原蛋白Ⅳ（Col Ⅳ）表达水平，通过促进SIRT1介导的NF-κBp65亚基去乙酰化抑制NF-κB信号传导，增强MC自噬进而抑制其增殖[66]。
结语与展望
大多数慢性肾脏疾病是进行性的，原发性肾病及糖尿病、高血压、感染、自身免疫性疾病等引起的继发性肾病中都存在足细胞凋亡、肾间质纤维化和肾小管萎缩。AS-Ⅳ能保护足细胞防止其凋亡，抑制肾间质纤维化，但是关于其能防止肾小管细胞凋亡的证据则很少，需要进一步研究证实。
AS-Ⅳ在慢性肾脏疾病的治疗中得到广泛应用，更多的分子机制将有待研究证实。明确AS-Ⅳ治疗肾脏疾病的靶标和途径能够为其在肾脏系统或其他系统疾病中的应用提供依据。另外，已有研究表明AS-Ⅳ以剂量依赖方式防止足细胞凋亡和抑制肾脏纤维化[8,21,66]，因此有必要就其剂量和安全性问题做进一步探索。
（选自《中草药杂志社》）