葡萄糖激酶(GCK)是一种对葡萄糖新陈代谢起关键作用的酶，因此被视为治疗糖尿病的良方。我们发现链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病鼠模型在高血糖水平下GCK呈现低表达水平：另外，在缺乏白细胞介素-10( IL-10)的模型中观察到肾小球性肾炎加重。虽然T淋巴细胞渗透进入STZ诱导的糖尿病小鼠的肝脏和胰腺，但是体外实验发现加入了STZ后的Thl辅助细胞和Th17辅助细胞极化显著减少。与野生型GCK基因(GCK261)相比，去除2643位点的胞嘧啶后的突变GCK基因(GCK262)，蛋白表达下降，蛋白质泛素化降解率增加。我们还进一步观察到hsa-mir-1302能与突变GCK的3’非翻译区结合，减少GCK的mRNA转译。最后，与单一胰岛素疗法相比，静脉注射突变GCK能更有效地降低STZ疗法糖尿病鼠模型的血糖水平。与此类似，突变GCK在12天或70天内均可持续、适度降低GK大鼠的血糖水平，且不会导致血糖过低，而胰岛素仅在12小时之后有效。这些结果表明突变GCK在未来可用于治疗糖尿病。

前  言

糖尿病是一种以高血糖水平为特征的慢性疾病它的形成原因多种多样。世界各国的糖尿病患病率均较高，根据发病年龄，糖尿病一般分为Ⅰ型糖尿病(TID)和Ⅱ型糖尿病（T2D）。从广义上来说，T2D影响的细胞类型众多，但并非全部都与新陈代谢功能直接相关。全基因组协会研究已确定不同细胞内的多种蛋白与糖尿病密切相关。比如，T细胞特异性高迁移率族蛋白(HMG)盒转录因子TCF7L2目前被认为是最强的T2D基因标记。^{【文献1、2】}与此类似，同源性磷酸酶一张力蛋白(PTEN)的β细胞表达已证明可促进T2D发展。^{【文献3】}除了以上列举的蛋白质外，还有已知可与胰岛素相互作用的一些蛋白质被确定为关键因素。其中包括在多种细胞中均有表达的葡萄糖激酶（GCK）。^{【文献4】}作为一种己糖激酶，GCK可催化葡萄糖的磷酸化，使葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸酶，所以一般被认为是葡萄糖常规代谢的首要催化剂。^{【文献5】}GCK还能用来检测细胞内的葡萄糖水平。不同组织内的一些种类不同但功能相似的亚型中均有GCK存在，其表达水平也不尽相同。不同的GCK基因突变可导致不同类型的糖尿病，主要为MODY和T2D^{【文献6】}。

研究者们曾尝试过多种不同的T2D治疗方法，其中一些疗法重点围绕胰岛素展开。二甲双胍的主要作用是增强对胰岛素的敏感性，而磺酰脲类则可以刺激β细胞的胰岛素分泌。^{【文献7、8】}格列奈类和噻唑烷二酮类等次优药物的功能基本类似，均是针对胰岛素。^{【文献9、10】}最近，钠-葡萄糖协同转运体2抑制剂开始作为替代疗法使用，通过阻止肾脏对葡萄糖的再次吸收，达到消除多余葡萄糖的目的。^{【文献11】}许多患者在接受减肥手术后，其血糖水平也回落到了正常范围。^{【文献12、13】}但是，这些疗法的副作用均十分明显，如体重增加、潜在低血糖症，而且单独使用时，这些疗法的疗效并不稳定。因此，我们显然还需要新的T2D 治疗方法。

在本文中，我们采用基因疗法，通过一种包装腺病毒的新型突变GCK 基因来治疗T2D。我们在不同T2D 动物模型上对该基因进行了多项体外和体内试验，包括GK大鼠和STZ诱导的糖尿病小鼠。经证明，突变GCK 基因可与hsa-mir -1302 相互作用，改变细胞内的分子机制，从而降低和控制其表达水平。在受控表达下，血糖水平下降的幅度更为平缓。以上结果表明，在糖尿病改善方面，突变GCK基因比胰岛素和普通GCK基因更有效，且可以长期稳定地控制血糖水平。

结  果

STZ 降低糖尿病鼠型的GCK表达水平

我们首先要确定糖尿病鼠型，特别是常用的、能有效模拟糖尿病的链脲霉素（STZ）模型中的GCK变化是一致的。^{【文献14】}STZ已知可优先靶向并杀死生成胰岛素的胰岛β 细胞，因为这些细胞中可被STZ吸收的葡萄糖转运体2（GLUT2）的表达水平较高。^{【文献15】}对B6 小鼠注射150 mg/kg ^-1 STZ，3 天后小鼠血糖水平显著单调升高，并持续至注射后16 天（图1a）。接受STZ疗法的小鼠在死亡日的体重显著下降（图1b）。根据我们的预期，采用STZ 疗法后，GCK 在肝细胞的蛋白水平（图1c）和信使核糖核酸（mRNA ）水平（图1d）上的表达量明显下降。该结果与其它团队之前的报告一致。

鉴于其它团队之前已证实糖尿病的T细胞耐受性在糖尿病发病机制中发挥关键作用，我们又进行了小鼠研究，以确定小鼠中T 细胞相关的免疫系统改变。^{【文献16、17】}值得注意的是，在血糖（附图1A）和体重（附图1B）方面，STZ 对IL-10^−/−小鼠的影响比对野生型（WT）小鼠更为显著。与接受STZ疗法的WT 小鼠的血糖（附图1C）和体重（附图1D）对比可知，IL-10^−/−小鼠的GCK表达的下降程度也更明显。组织学分析还显示，相对于WT 小鼠，IL-10^−/−小鼠的肾组织炎性细胞浸润数量更多（附图1E）。这些肾小球性肾炎的体征具有重要意义，它们是导致患者T2D 加重的负反馈环的一部分。^{【文献18、20】}

基于该结果，我们进一步对T 细胞在控制GCK表达中的潜在作用进行了研究，因为IL-10 被认为对效应T 细胞系有较强的抑制作用。对肝切片（附图2A）及胰腺切片（附图2B）做免疫荧光染色后，在STZ 处理小鼠的胰腺中发现大量CD3⁺细胞浸润。随后从患有STZ诱导的糖尿病的WT 小鼠和患有非STZ诱导的糖尿病的WT 小鼠中分离出脾细胞，在特定辅助性T 细胞极化条件下进行体外培养，用流式细胞术检测。STZ 治疗组中， Th17 细胞群的白介素-17（IL-17）分泌明显减少，同时IL-17 阳性细胞的总数下降（附图3A）。STZ 治疗组的干扰素γ 阳性Th1细胞数也同样减少（附图3B）。但是，IL-4 阳性Th2细胞却未发现受到明显影响（附图3C），表明STZ的作用可能是有选择性的。由于尚不清楚辅助性T 细胞系是否能够表达可被STZ吸收的GLUT2 受体，所以无法准确判断STZ对这些细胞的抑制机制。

我们进一步将STZ 模型应用于重排活化基因（Rag）^−/−小鼠，以确定GCK 表达是否与T 或β细胞活性相关。与接受磷酸盐缓冲盐水（PBS）疗法的小鼠相比，接受STZ 疗法的Rag 缺陷小鼠的血糖水平（附图4A）显著升高，体重（附图4B）下降。同时，肝脏中的GCK 蛋白表达（附图4C）下降，GCK的mRNA 表达水平（附图4D）呈较大的倍数变化。但是，血糖水平的变化模式和体重波动模式与WT 小鼠无明显差异。

突变GCK 的蛋白表达水平较WT GCK 低

虽然我们无法确定GCK 表达与免疫功能明确相关，但我们的研究结果明确显示，血糖水平的升高的确与GCK 抑制存在关联。尽管之前已有团队确定了上述相关性，并试图通过GCK 过表达，利用该相关性来治疗糖尿病，但他们在利用过表达控制血糖水平时遇到了一些困难，并且出现血糖过低现象。因此，我们尝试设计一个GCK 的突变版本，可更方便地控制过表达（附表1）。蛋白质中的直接突变会引起意料之外的有关外来蛋白质结构的副作用，并可能引发内质网应激，所以我们决定删除2643 位点的胞嘧啶，泛素化途径在蛋白质降解中具有重要作用，因此我们将突变GCK 质粒转染为293T 细胞，转染后细胞的GCK表达水平明显低于WT 模型（图2a 和2b）。^{【文献21、22】}因此，我们下一步对引起突变体中GCK低表达的分子机制进行了验证。首先，我们培养了WT GCK 和突变GCK 过表达的293T 细胞，然后用环己酰亚胺中止mRNA 合成30 min ，最后在使用或不使用蛋白酶抑制剂MG132 的情况下对细胞进行处理。处理后的突变GCK 降解水平在12 h 、24 h 内高于未处理的对照组，WT GCK表达水平稳定（图2c）。在蛋白质稳定性测定中，突变GCK和WT GCK 的泛素化水平几乎相同（图2d）。我们进一步使用给定的赖氨酸泛素质粒进行转染，结果表明K48 和K63 对GCK 泛素化无特别影响（图2e）。上述结果表明GCK蛋白质降解可能涉及到非泛素化依赖的途径。虽然3'-UTR 的改变可能会导致蛋白质结构发生变化，但是这种可能性并不大，因为这种情况下的突变对终止子无明显影响，也不会引起移码。

hsa-mir -1302能够与突变GCK的        3'-UTR结合

我们发现泛素化途径翻译后修饰中的突变GCK 降解水平更高。蛋白表达包括转录活性和翻译活性，因此我们下一步对可能会影响到蛋白表达观察水平的其它现象进行了研究。mRNA 稳定性早已被确定为蛋白表达的控制因素之一，而根据发现，微小核糖核酸（microRNA ）对mRNA 活性具有潜在影响。^{【文献23、24】}因此，我们进行了相关研究，以确定对在3'-UTR中的删减是否改变了GCK mRNA 的miRNA 控制能力。通过序列分析，我们发现miRNA hsa -mir -1302是突变GCK 3'-UTR 的潜在结合配偶体（图3a）。^{【文献25】}虽然hsa-mir -1302 在突变3'-UTR 中的结合不是完全集中的，但是之前已有团队证明结合部位不完全集中属常见现象，仍然可以有效阻遏mRNA 。因此，我们利用hsa-mir-1302仿制品，通过试验分析了hsa-mir-1302与GCK3'-UTR 的结合情况。^{【文献26】}hsa-mir -1302仿制品不影响WT GCK 的蛋白表达水平，但是随着剂量的增加，突变GCK 的表达水平显著下降（图3b ）。与此类似，加入hsa-mir -1302抑制剂后，WT GCK 的表达也未受影响，而突变GCK 的表达水平则略微升高（图3c）。综上所述，hsa-mir -1302 可减少突变GCK 的转录活动，但对WT GCK 的转录则没有影响。图3 hsa-mir -1302 直接靶向突变GCK。（a）对hsa-mir -1302 和WT GCK 或突变GCK 3'-UTR 的推定靶部位的碱基对进行比较。（b）WT GCK 或突变GCK3'-UTR荧光素酶构建体与不同剂量hsa-mir -1302仿制品共转染293T细胞40h。经荧光素酶测定，荧光素酶活性恢复为正常的β-半乳糖苷酶活性。数据来自三个独立实验，表达为平均值±标准差。单向方差分析（ANOVA），*P＜0.05。（c）将WTGCK或突变GCK过表达质粒用hsa-mir -1302抑制剂转染293T细胞或打乱序列48h 。使用GCK 抗体进行蛋白质免疫印迹检测。以β-Actin 为对照。NS= 不显著。

突变GCK 在体内以受控速率降低血糖水平

根据我们对GCK 突变体的体外活性和表达的深层机理的理解，我们进一步将这些发现应用于体内研究，以确定它们是否能用来有效控制血糖水平。我们向GK大鼠静脉注射腺病毒包装的WT GCK和突变。

GCK，观察15天存活率和血糖水平变化。结果显示注射WTGCK的GK大鼠有40%死亡，而突变GCK组未出现死亡（附图4A）。我们还发现WT GCK组的血糖水平急剧下降，而突变GCK组的血糖水平下降则较为适中、平稳（附图4B）。之后，我们研究了腺病毒载体是否促进了STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖水平下降。我们用腺病毒载体和包装过的突变GCK感染STZ处理的WTC57BL/6J小鼠，持续8周。实验期间，注射突变GCK的小鼠的血糖水平呈稳定显著下降，而接受腺病毒载体的小鼠的血糖则持续保持较高水平（图4a）。更重要的是，mGCK处理的小鼠未出现血糖过低现象，它们的血糖水平从未低于阴性对照的血糖水平。根据上述结果，我们对GK大鼠的GCK突变体进行了检测，这些大鼠的T2D正常发展，无肥胖现象，然后与传统胰岛素疗法的疗效进行对比。^{【文献27】}血糖监测发现在突变GCK皮下注射后的24h内，血糖水平未发生明显变化，而胰岛素组的血糖水平则急剧下降（图4b）。因此，我们接下来分3次连续3天皮下注射突变GCK，观察12天内的疗效情况。血糖水平在第4天出现显著下降，该下降趋势稳定持续至第12天。与突变GCK相此，胰岛素的效果持续时间不长，血糖水平从第4天开始回升并持续至第12天。显然，突变GCK疗法可更长期地控制血糖水平（图4c）。为进一步验证该发现，我们再次进行了相同实验，分9次连续给药，观察之后70天的血糖水平。给药后突变GCK处理组的血糖水平降至正常范围，并在第19天达到最低值，随后逐渐回升，直至第70天。由于实验使用的GK大鼠在实验开始时的鼠龄为10周，而大鼠在鼠龄14-15周时会自然增长，18周后进入停滞期，因此在给药第26天后，其血糖水平预期会缓慢升高。与传统胰岛素疗法相比突变GCK疗法可以将血糖长期保持在较低水平，效果更为稳定（图4d）。

我们还检测了腺病毒颗粒拷贝数，以确定肝脏的mGCK水平。结果显示，连续14天皮下注射mGCK或载体后，病毒拷贝数在停药第1天达到最高值。随后，在第7、14、21、28天呈下降趋势，与mGCK组的血糖水平升高一致，mGCK载体组无疗效表现。但是，对照组和mGCK组在各时间点无明显差异，可以排除载体对mGCK疗效的影响（附图6a-c）。

讨  论

糖尿病是一种需要长期治疗以控制血糖水平的慢性疾病，其中高血糖症和低血糖症均会对健康产生严重影响。就这一点而论，糖尿病的疗法须易于长期使用，同时几乎不会引起大幅度血糖波动。本文表明通过基因疗法给予的突变GCK可在GK大鼠身上持续作用2个月，使其血糖水平逐渐降低并保持稳定。载体也没有引发有害的免疫作用，这是所有的基因疗法应用中令人关切的问题。正因为如此，将突变GCK用于长期治疗是可行的。我们基于体外实验，发现抑制作用背后的分子机制与microRNA hsa -mir-1302的活动有关，后者可与GCKmRNA相互作用并影响其稳定性。我们进一步表明IL-10的表达与糖尿病的严重性有关，尤其是在发生肾小球性肾炎的情况下。

mRNA 调控渐渐被公认为蛋白表达调控的关键因素，并已成为更大的关注点。mRNA 调控的一个令人感兴趣的方面是它们的稳定性。由于mRNA 的单链性质，其通常被认为不如DNA 稳定，在不同细胞类型之间，mRNA 的稳定性仍会有很大差别，尤其是在正常的有核细胞与诸如红细胞和血小板的无核细胞之间。之前已就控制mRNA 稳定性的能力对各种因素进行研究，例如3'端和5'端多聚腺苷酸化尾的长度。最近，已证明长度短的mirRNA与大量mRNA 相互作用，尤其是在mRNA两端的非翻译区(3'非翻译区和5'非翻译区)。^{【文献28、29】}此类相互作用可通过直接阻断或间接通过其他因子的聚集，强烈影响mRNA 的稳定性/ 翻译。然而，正如几个团队所展示的那样，当假定上述mi rRNA的相互作用甚至是目的mirRNA的存在时，需保持谨慎。毕竟，并非所有含有开放读码框架的基因组非蛋白质编码区都必然会为RNA 编码。最明显的例子是端粒和着丝粒的DNA 区，同时也存在其他较不明显的非编码区。在目前的研究中，我们将可能存在的mirRNA的互动假定为GCK mRNA 下调的潜在机制。我们通过序列分析假定存在上述相互作用，然后通过直接进行体外和体内实验证明这一点。利用microRNA 的作用调控蛋白表达水平，本质上作为较安全的剂量调节方法，也适用于已被证实为难以调控蛋白表达水平的很多其他基因药物治疗。

也可能存在GCK 表达改变所引起的我们在本文中最终还无法识别的其他免疫作用。毕竟，很多研究已报道代谢和代谢因子的变化可改变免疫反应，以及免疫失衡状态，例如M1 与M2 巨噬细胞之间的失衡，以及Th17 与调节性T 细胞之间的失衡。^{【文献30、31、32】}虽然在STZ 诱导的IL-10^-/-小鼠模型上观测到更明显的差异，但我们的结果没有显示出平衡明显偏离特异性辅助性T细胞表型的现象。IL-10缺失的严重性增加，确切原因并不完全清楚，但可能与IL-10正常发挥的免疫作用有关。这些作用可包括T效应表型的抑制，此抑制会限制T效应表型的空间扩展并减少其对肝的浸润。IL-10可在“细胞因子减少”时刺激调节性T细胞群或指导抑制剂增加细胞因子。我们将通过进一步工作更清楚地了解相关机制。

在目前的研究中，我们采用基因疗法给予改良GCK，以治疗T2D。上述概念本身并不完全是一个新概念，因为其他团队也已试图采用类似方法治疗糖尿病。然而，已表明直接引入完整的WT GCK基因会导致血糖水平不受控制地下降，这可能是产生太多蛋白质的结果。上述不受控制的下降会导致低血糖症，这是糖尿病患者的严重及危险的副作用。在我们开展的体内鼠实验中，采用的新的突变GCK 使血糖水平以缓慢但更可控的方式下降，并且不导致低血糖症。我们证明与采用标准WT基因感染的诱导方法相比，STZ激发的小鼠的GCK表达水平明显反弹到更低水平。这些结果随后在GK大鼠身上进一步得到证实，其中从长远来看，突变GCK疗法优于胰岛素疗法，表明突变体诱导的GCK蛋白质水平足以管理高血糖症。

材料与方法

小鼠和大鼠

C57BL/6J（B6，货号：000664 ），IL10-缺陷小鼠（B6.129P2-Il10tmCgn/J ，货号：002251），MyD88 -缺陷小鼠（B6.129P2（SJL）-Myd88tm.1.1Defr/J ，货号： 009088）和Rag1-缺陷小鼠（B6.129S7-Rag1tm1Mom/J ，货号：002216）从杰克逊实验室获得（美国缅因州巴尔港）并存放在西奈山医学院的屏障设施内（美国纽约州纽约）。所有实验均采用6—8 周的雌性小鼠。动物研究方案经过西奈山医学院和弗吉尼亚理工大学实验动物照护及使用委员会的批准。雄性Goto Kakizaki大鼠从中国科学院上海实验动物中心购进，体重约为300± 50 g 。所有大鼠实验均按照杭州一元生物技术有限公司动物照护委员会的确定的方案开展。

抗  体

以下抗体用于指定的免疫印迹法和免疫沉淀反应的稀释。泛素（sc-8017，1:300）和GCK（sc-7098 ，WB 1:300 ，每100–500 μg 的总蛋白有1–2μg IP）购自圣克鲁斯生物技术公司（美国加州圣克鲁斯）。Anti -HA-tag 抗体（SAB4300603，1:500）购自西格玛奥瑞奇集团。关于流式细胞术，荧光标记IL-4 抗体（11B11，藻红蛋白荧光素标记）、干扰素-γ（XMG1.2，别藻蓝素标记）和CD4（GK1.5，异硫氰酸荧光素标记）均购自eBioscience 公司（美国加州圣地亚哥），用于1:100 的稀释。IL-17 抗体（TC11-18H10.1 ，藻红蛋白标记）购自Biolegend公司（美国加州圣地亚哥），用于1:100 的稀释。

RNA 分离和定量实时RT–PCR

用RNeasy Plus 试剂盒（美国加州巴伦西亚Qiagen 公司）提取总RNA，用qScript cDNA 合成试剂盒（美国马里兰州盖瑟斯堡QuantaBiosciences 公司）生成cDNA ，随后用iCycler PCR和SYBR Green PCR预混母液（美国纽约州格兰德岛美国应用生物系统公司）进行分析。选择程序，对单样本进行目标基因CT 值与持家基因（泛素）的比较，采用公式：10 000x2^−ΔΔCT。使用以下引物集：GCK—正义， 5'-GAAGCGGCCCATGAGGTACT-3'和反义，5'-GTAACAACTCCGCCCCATT-3'；泛素—正义，5'-TGGCTATTAATTATTCGGTCTGCAT-3'和反义，5'-GCAAGTGGCTAGAGTGCAGAGTAA-3'。

免疫印迹分析

肝匀浆和用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗过的转染293T 细胞在0.5 ml 含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（50 mM Tris -HCl，pH 8.0 ，280 mM NaCl ，0.5%的乙基苯基聚乙二醇，0.2 mM 乙二胺四乙酸，2 mM乙二醇双氨乙基醚四乙酸，10%的甘油和1 mM 二硫苏糖醇）中冰上裂解15 分钟。通过离心分离澄清细胞溶解物（4℃，15 min ，14 000 r.p.m.），蛋白质进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，实施免疫印迹法。根据生产厂家的说明使用抗生素。第二抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。

转染和荧光素酶报告基因检测

将GCK 超表达质粒或GCK 3'-UTR 荧光素酶报告基因质粒转染到经不同方法处理的293T 细胞。每次转染时，将2.0μg 质粒与100μl 达尔伯克改良伊格尔培养基（无血清和抗生素）和4.0μlLipofectamine 2000试剂（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）混合。在室温下培养混合物20分钟，然后在含有细胞和完全培养基的12 孔板上添加混合物。培养细胞30小时，用报告基因裂解缓冲液（美国加州圣路易斯奥比斯波市普洛麦格公司）收获细胞以测定荧光素酶活性。用β-半乳糖苷酶报告基因质粒共转染到细胞中，使转染效率实验标准化。

STZ 诱导的糖尿病鼠模型

对小鼠进行单次STZ（150 mg kg ^-1；美国密苏里州圣路易斯市西格玛奥瑞奇集团）腹腔内注射。每日测量血糖和体重。体重下降至原来的20%左右时，杀死小鼠取出肝、胰、肾和脾，进行进一步分析。

GCK 或胰岛素治疗

对两组WT 小鼠（图4a）采用单次腹腔注射STZ诱导，然后予腺病毒载体（1.65x10 ¹¹病毒颗粒/ 千克）或mGCK（1.65x10 ¹¹病毒颗粒/ 千克）治疗，每2天皮下注射6 次。在接下来的52 天进行血糖检测。

GK 大鼠皮下注射腺病毒载体（1.65x10 ¹¹病毒颗粒/ 千克）、胰岛素（1U kg ^-1）或mGCK（1.65x10¹¹病毒颗粒/ 千克），一次性注射（图4b）或分3 次连续注射3 天（图4c）或分9 次连续注射9 天（图4c）。注射后进行血糖检测。

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（作者简介：黄海东 1993年至1997年日本京都大学医学院生物化学系研究生毕业；1998年至2006年就职于日本武田制药进行药物研发工作；2006年至今成立杭州一元生物技术有限公司任董事长，从事糖尿病药物研发。）