统计分析在洁净室污染评估及风险分析中的应用研究

洁净室在医药企业的生产中占有核心的地位，其洁净效果直接影响所生产药品的质量。因此，保证洁净室的环境质量对医药企业而言极其重要。随着新版GMP的实施，对洁净室的要求越来越高，特别是对于无菌药品生产企业而言。为更有效地控制洁净室的环境，需对洁净室进行监控，利用日常监测数据进行污染与风险预测，最大限度地控制悬浮粒子与微生物的污染。长期以来，对洁净室污染与风险的评估及预测大多数是建立在经验上的，缺乏数理统计的应用。曾有文献通过相关性分析去解析县浮粒子与洁净度个别因素的关系，但是对洁净室主要区域进行污染评估与风险预测就鲜有报道。这就导致对人员的经验性要求高，适用性较差。本研究尝试通过对监测数据进行统计分析，通过数据分析结果对洁净室进行污染评价与风险分析，以及计算实验室相应的警戒限。

1、 食品与试药

MAS－100型微生物空气采样器（行署Merk公司）；3415型便携式空气颗粒计数器（美国MetOne公司）；TSA胰酪胨大豆琼脂培养基（北京三药科技开发公司）；BD－240型细菌培养箱（德国Binder公司）。

2、方法与结果

2.1监测地点和项目

本所实验室的洁净室（平面图见图1）有2个十万级区域[第一更衣室（用于完成更换无菌衣前的简单更衣及消毒工作，简称一更）和培养基配制室]，10个万级区域。万级区域中，有4个主要实验区域（微生物限度检查室、无菌1室、无菌2室、阳性接种间）是百级工作台的万级背景。根据GB/T16293-2010和GB/T16292-2010和方法，照 本所实验室的洁净室检测规程，对洁净室定期进行监测（3个月1次），并对监测数据进行汇总，监测项目包括温度、湿度、悬浮粒子数[≥0.5μm（小微粒）和≥0.5μm（大微粒）]以及浮游菌数。经过约3年时间（2009年2月至2012年1月）的监测，共得到12组检测数据。根据监测的数据，利用SPSS19.0软件进行统计处理、相关性分析及作图，从而了解洁净室的状态，并对洁净室进行趋势及风险分析。

2.2各因素的相关性结果

与洁净室相关的因素有温度、湿度、大微粒、小微粒及浮游菌数。对洁净室的状态进行分析时，首先对洁净室的各因素进行相关性探讨，了解各因素间的关系。由于整个洁净室分别有万级和十万级的洁净级别，在探讨相关性时，分别对万级区和十万级区进行统计。利用SPSS软件，对数据进行相关性分析。由于各因素的纲量不一致，先对数据进行均值为1的标准化处理，结果见表1。

注：括号内外分别是十万级区和万级区的相关性值

由表1可见，洁净室中的温度与湿度无论在十万级区域还是在万级区域，这两个因素的相关系数均相近，而且与其他因素均无关，说明了温度与湿度是由系统和环境控制。无论是在万级还是十万级区域，它们都是一对固有的系统因素，洁净室的使用过程中其他因素不会对其造成很大影响，而且温度与湿度存在一定的函数关系，因此温度与湿度存胡弱相关。由于温度与湿度是一对系统固有因素，而且与其他因素不相关（相关系数均小于0.4），因此在进行风险评估时，只要这两个变量在规定的限值内，就不会对洁净室带来潜在风险，因此可不对这两个因素进行分析。

图1   洁净室平面图

小微粒、大微粒和浮游菌数年虽然同样是环境因素，但在洁净室的使用过程中会对其带来不同程度的影响。

在万级区域下，由于已经对进入该区域的人员和样品进行了相应的消毒与自净过程，因此该区域下的小微粒、大微粒与浮游菌数受外源性的影响比较少，基本是由系统和环境控制，而且它们之前也不存在任何函数关系（见美国药典36版785-794页），所以在万级区域下这3个因素是相互独立的因素，需独立分析评估。

在十万级的区域下，小微粒与大微粒有强正相关（0.978），浮游菌数与小微粒和大微粒有弱正相关（相关系数接近0.5）。该区域与外界最近，进入该区域的人员和样品的消毒与自净过程相对较弱，因此该区域下的小微粒、大微粒与浮游菌数几乎都是从人流中夹带进洁净室的外源性污染，因此就导致了大、小微粒之间存在强正相关，浮游菌数与大、小微粒之间存在弱正相关。因此在这些区域存在的主要风险是人流所带来的污染，需控制人流。

2.3均值分析结果

在洁净室里，温度与湿度主要与工艺和体的舒适度有关，在这5项因素中影响洁净度与微生物检验结果的因素主要是大微粒、小微粒与浮游菌数。而均值是能反映整体情况的指标，因此以各洁净区域的大微粒、小微粒与浮游菌数均值作图，见图2。可见在4个主要实验区域（微生物限度检查室、无菌1室、无菌2室和阳性接种间）中，大微粒与浮游菌数均处在一个较低水平，说明主要的洁净区域对于外源性污染处于可控范围，能为百级工作台提供较好的背景保护。这4个主要的实验区域都是百级下的万级背景，悬浮粒子与浮游菌应处于基本一致的水平，然而在无菌1室和2室的小微粒均值稍偏高。这提示无菌室可能存在风险，翻查洁净室使用记录，发现无菌检查样品基本均为粉针原料抽样及粉末状样品检验（如粉针剂、粉末原料等），这样就有可能使系统无法对悬浮粒子马上自净，导致小微粒总体均值偏高。为了避免无菌室潜在的风险，须合理安排检品，要对粉末状样品分批分次检验，予以充分的自净时间与空间，不能过于集中，从而降低无菌室单位时间的负荷量，否则会带来样品交叉污染风险。

       
图2 浮游菌（A）、小微粒（B）和大微粒（C）的均值图

培养基配制室的大、小微粒与浮游菌数的均值均为最高，且远高于另一个十万级区域（一更），这反映了培养基配制室是人员与样品进出最频繁的区域，使用频率高（包括培养基的配制与灭菌），这是对洁净室带来潜在风险可能性最大的区域，需特别关注。

2.4标准差分析结果

均值只能反映某个洁净区域的总体情况，但不能反映不同时间监测的数据偏离均值的情况，因此计算了各区域的大微粒、小微粒与浮游菌数的标准差，以此作图，考察离散程度。结果见图3。可见4个主要实验区域（微生物限度检查室、无菌1室、无菌2室和阳性接种间）中除无菌1室外，悬浮粒子、浮游菌数的标准差均处在一个较低水平，说明这3个区域的波动不大，高于这3个区域，这就提示无菌1室可能存在风险，翻查洁净室使用记录，无异常。这很大可能是检验人员没有严格按照标准操作规程进行试验所造成的，也可能是某几次试验没有对样品进行彻底消毒，引入了外来微生物污染，影响了数据均一性。需要对人员加强培训，严格按照标准操作规程进行实验。

培养基配制室同样是3项标准差中最大的区域，说明了这个区域不仅是人员进出最频繁，而且没有规律性，因此导致数据偏差大。需要控制人员进出，抵制潜在风险发生的可能性。

3、结论与讨论

根据相关性、均值和标准差的结果，可以对洁净室进行改进和风险评估，制定适合的警戒限。

在系统稳定的情况下，大、小微粒和浮游菌数的总体均值是固定，根据相关文献可以假设大、小微粒与浮游菌数挖正态分布，把均值加上2倍标准差作为关键区域（百级工作区的万级背景）大、小微粒和浮游菌数的警戒限（结果见表2）。从表2结果可见无菌室的小微粒警戒限较高，已经接近国标限度（大微粒≤350000；小微粒≤2000；浮游菌≤100），这说明无菌室存在风险的可能性要比微生物限度检查室高，因此需更关注无菌室的洁净状态，进行调查后采取相应的措施降低小微粒及浮游菌的警戒限。这样比单纯提高标准要求或领先经验，更具有科学性和适用性。

以往都认为洁净室内各因素均各自独立，无明显相关性，但从上述分析可见，温度与湿度存在一定的相关性。对于万级洁净区，各因素均无明显相关性；而在十万级洁净区，部分因素存在一定的相关性。在监测时，对于十万级区域可通过相关性考察，减少监测项目。

综上所述，4个主要实验区域（微生物限度检查室、无菌1室、无菌2室和阳性接种间）基本处于一个稳定的状态。但也存在一定的风险，需要加强培训；合理安排检品，要对粉末状样品分批分次检验，予以充分的自净时间与空间，不能过于集中，降低无菌室单位时间的负荷量，否则会带来风险。培养基配制室是所有区域中最不稳定的一个，压根对其人员进出进行控制和管理，以免其对洁净室内部造成潜在风险。

药品生产企业还可制定频数表，根据警戒限得到超限的发生频率，然后翻查生产记录，找出超限原因，这样可根据超限原因与发生频率，以及严重性，建立风险评估体系。