眼部药动学取样方法的研究进展

  　  摘要：眼部药动学是眼部给药系统的重要研究内容，眼部取样方法则是眼部动力学研究中的关键。本文综合了国内外近年来的文献报道，简介了眼部主要疾病及眼科新药，主要阐述眼部取样的各种方法及其优缺点。

  　 眼部疾病的治疗主要有两种途径——全身给药和局部给药，前者给药剂量大，易引起不良反应；后者针对性强，全身不良反应小。在眼科新药开发过程中首先要开展眼部药动学的研究，通过研究得到眼部药一时曲线，了解药物在眼部的代谢特征，对药物的剂型设计及给药方案有重要作用。其中眼部取样方法是眼部药动学研究的关键。由于眼部的解剖和生理结构复杂、内源性干扰因素较多且局部药物浓度低，增加了眼部取样的难度。眼部药动学研究多采用家兔为实验对象，因兔眼的生理解剖参数和人眼较接近，也有研究采用猴、犬、豚鼠、牛、大鼠等动物。人眼可方便采集的只有泪液，另外在手术中可取得部分角膜、房水、玻璃体等组织用于分析检测。本文将在简单介绍眼部的主要疾病及眼科新药开发热点的基础上，综述近年来眼部药动学取样方法的研究进展。

1、眼部解剖结构和主要疾病

 　  眼分为前段和后段，前段由眼前部分的1/3构成，主要包括瞳孔、角膜、虹膜、睫状体、房水及晶状体；后段由眼后的2/3构成，主要包括玻璃体、视网膜、脉络层、黄斑及视神经等。眼科常见的疾病包括老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病黄斑水肿(DME)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、葡萄膜炎、巨细胞病毒感染、结膜炎、青光眼和白内障等。表1中汇总了上述疾病的分类和治疗方案。

 　  FDA近5年批准的眼科新药共13个，其中新分子实体3个，分别为他氟前列腺素(tafluprost)、阿柏西普(aflibercept)和贝西沙星(besifloxacin)；生物制剂1个，ocriplasmin;新制剂9个，包括更昔洛韦( ganciclovir)凝胶、依碳酸氯替泼诺(loteprednol etabonate)油膏、二氟泼尼酯(difiuprednate)乳液和地塞米松(dexamethasone)玻璃体注射植入剂等（见表2）。其中，他氟前列腺素是第一个无防腐剂的前列腺素类似物眼科溶液；半胱胺滴眼液是唯一被FDA批准用于治疗胱氨酸病的眼科药物；贝西沙星是首个眼科专用的氟喹诺酮类药物。从新药开发的角度来看，眼科新药不仅着重于新分子实体的研发，新型缓释制剂也是研究的热点。减少给药频率、提高药物生物利用度和眼部耐受性及提高患者的依从性是眼科新制剂的主要特点。此外，眼用制剂中防腐剂的控制也是近年来研究者较关注的问题之一。

2、眼部药动学的取样技术

 　  药物在眼部发挥疗效，主要取决于药物在眼组织的通透性，即药物通过眼生物屏障的能力，主要包括泪液，眼屏障和血一眼屏障（血，房水屏障及血，视膜屏障）。眼用药物局部给药后，仅少量药物经角膜进入房水，然后分布到巩膜、睫状体、视网膜等组织而被吸收。目前，眼部药动学的取样技术主要有以下几种：

    2.1组织匀浆法

 　  本法可测定药物在眼部各组织中的分布，是药动学取样的经典方法，应用广泛。但因动物个体间差异和其非连续的取样方法使获得的动力学曲线存在较大误差，且动物消耗量大。

　Ward等对贝西沙星滴眼液的动力学进行了临床前研究。试验前用裂隙灯和检眼镜对新西兰兔进行眼科检查，筛选出角膜、结膜、巩膜上的血管，前房，瞳孔，晶状体及视网膜无异常的动物待用。兔眼结膜囊给药后，轻轻闭合眼睑几秒，以减少药物的流失。在设定的时间点将动物处死，摘除眼球后，将结膜、房水收集到样品管中，称重，迅速冷冻。样品经二氯甲烷液一液萃取后，采用HPLC-MS/MS法分析药物浓度。贝西沙星在眼部的平均滞留时间大于7h，且单剂量给药后结膜中药物浓度高于90%抑菌浓度的维持时间大于12 h。该结果表明了贝西沙星对眼部病原菌治疗的有效性。

 　  Fukano等用此法研究了他氟前列腺素滴眼液给药后在猴眼组织中的分布。用微量移液管在猴眼角膜滴入不同浓度的单剂量他氟前列腺素（用3H标记）滴眼液后，在确定的时间点处死动物，收集眼部组织，匀浆后进行放射性分析。结果给药2h后，眼前段和后段的放射活性达到最高值。他氟前列腺素局部给药后在眼部组织吸收良好，临床应用前景较好。

    2.2穿刺取样法

   　本法主要用于房水和玻璃体液的取样。到目前为止，在药物眼部动力学研究中，大多是对前房和（或）玻璃体的单次取样。通常是在给药后的不同时间点将动物处死，随即对房水或玻璃体进行取样。组织匀浆法中房水的收集通常也采用穿刺法。

 　  Ogundele等[11]用此法研究了0.01%和0.03%的比马前列素滴眼液穿透到兔眼房水的能力。试验中，分别在兔双眼中滴入不同规格的比马前列素滴眼液，30或90 min后，用28号注射针收集房水，每个时间点取样4个。样品经处理后用HPLC法分析药物浓度。结果表明，与0.03%的比马前列素滴眼液相比，0.01%规格的制品中药物在房水中的平均浓度较低。

  　 Dong等研究了防腐剂碳酸钠对溴莫尼定在兔眼房水中生物利用度的影响。在动物结膜囊内滴入药物后，轻轻闭眼5s。用30号针头注射器在确定时间点穿刺取样，样品处理后用LC-MS/MS法分析药物浓度。结果显示加碳酸钠的溴莫尼定比不加时在兔眼房水中具有更高的峰浓度。

　   穿刺法操作较简单易行，但也是非连续的取样方法，不仅动物消耗量大，且因个体间差异，结果偏差较大。由于动物处于麻醉状态下，对其眼内的药动学行为也可能有影响。

    2.3微透析法

 　  微透析是以渗透原理为基础，检测细胞外间隙中内源性和外源性物质的在体取样技术。将微透析探针植入机体组织后，组织液中的药物即通过透析膜与灌注液进行扩散交换，扩散到灌注液的药物被不断带出，从而实现在体连续取样。目前微透析技术已用于脑、血、肝、肌肉、肾、关节和眼部等组织的取样。为确定眼部给药后药物的生物利用度，微透析技术常用于玻璃体、视网膜和房水的取样。

 　  Wei等用微透析法研究了噻吗洛尔热敏凝胶给药后的药动学特性。麻醉动物后，在距巩膜角膜边缘2 mm处用20号针头将微针植入角膜，并从内端跨到外端，移除针头后，调整微针透析窗使其完全位于前房内。角膜处的伤口用0.3%氧氟沙星溶液处理。微针用含有肝素的生理盐水灌注，动物恢复至少5d后才可用于试验。给药前，微针用生理盐水灌注30 min，然后在角膜表面滴入噻吗洛尔凝胶剂，每15 min收集一次，共收集4h，用HPLC法分析药物浓度。结果表明，与噻吗洛尔溶液相比，噻吗洛尔凝胶的tmax略延后而Cmax有所提高，生物利用度也提高了1.6倍。

 　  Macha等用此法研究了3种更昔洛韦双酯前药（乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐）玻璃体给药后在眼部的分布。试验中雄性新西兰白兔始终处于麻醉状态。插入同心微透析探针( concentric microdialysis probe)前，先在眼部滴入2滴1%托吡卡胺扩瞳，然后将21号注射针穿过睫状环插到角膜巩膜缘下3～4 mm，移开注射针后，立即沿同一位置插入探针，并调节探针使透析膜位于玻璃体中部；线性微透析探针(linear microdialysis probe)插入前房时使用25号注射针，将注射针从角膜的一端近边缘插入，横穿过前房达角膜的另一端，将探针的样品收集端插入注射针的斜面端，缓慢抽出注射针，使透析膜停留在前房中间。分别固定两种探针的样品收集端，避免样品收集的过程中受到干扰。通过微量输液泵向探针内注入流速为2 μl/min的等渗磷酸盐缓冲液。探针植入后稳定2h方可给药及取样。为证明探针插入前房和玻璃体腔后，血眼屏障保持完整，试验过程中还应测定眼内压、蛋白浓度和标记物浓度的变化情况。更昔洛韦和其双酯前药通过玻璃体给药后，每20 min取样1次，样品浓度用HPLC法分析。更昔洛韦的二乙酸盐、二丙酸盐和二丁酸盐的体内滞留时间分别为(356±16)、(341±11)和(324±19)min，约是更昔洛韦[(185士28)min]的2倍。

  　 微透析技术与传统方法相比误差较小，大大减少了动物的使用量；对组织的损伤小，能避免紊乱的灌注液进入组织间隙；无组织液损失，可连续、不间断的长时间取样；可获得无蛋白的样品，因此可直接进行HPLC检测而无需预处理。但微透析技术有时也可造成一定的组织损伤和细菌感染。

    2.4泪样采集法

　   本法具有操作简单，动物消耗量小，药物代谢后可循环使用等优点，但只能考察药物在眼表的滞留时间和释药速度。此外，生理特征使泪液的采集有一定难度。其一，泪液体积很少，难于取出，并且失去泪液中蛋白质的保护作用，角膜和结膜的结构可能会发生改变。其二，取样过程中须限制眨眼反射，耐受性差，产生的周部刺激影响泪液的分泌量，然而，预先的刺激又通常是取得足够的泪液所必须的。其三，这种带有侵害性的采样所引起的定性或定量的改变如血管的收缩可能会导致眼内的持续高压。

   　 泪液采集最常用的是滤纸条法和毛细血管法。

    2.4.1滤纸条法

 　   滤纸条法原本是利用泪液对染料的稀释作用对分泌的泪液进行定量，从而诊断干眼病的方法。亦可用于取泪样测定泪液中药物浓度的经时过程。取样时滤纸条先称重，然后将其一端插入动物眼部结膜囊下，放置一定时间使泪液渗入。取样量通过取样前后重量的差异得出。

 　  Amar等用滤纸条法进行了兔眼单次和多次滴入阿奇霉素的药动学研究。用微量吸液管在动物的右眼单次或多次给药后，在设定时间点用Schirme试纸条收集泪液，当泪液到达第二分度时取出，立即称重，采用HPLC-MS法测定药物浓度。结果显示单次给药后，阿奇霉素在泪液中的浓度高于易感菌最小抑菌浓度的时间至少可维持4h，多次给药则达到了16 h，表明阿奇霉素在泪液中的浓度及有效浓度维持时间都能满足治疗的需要。

  　  Raizman等用滤纸条法考察了左氧氟沙星在人泪液中浓度的经时变化。志愿者眼部给予0.5%左氧氟沙星后，在9个时间点用滤纸条左眼角取样，放置5 min使滤纸饱和。样品经称重及处理后，用HPLC法测定药物浓度。结果表明，左氧氟沙星单剂量局部给药后，眼部药物浓度很快达到较高水平，并在大多数志愿者中至少可维持最低抑菌浓度（针对多数眼部致病菌）6h，在一些志愿者中甚至可达到24 h。

  　  滤纸条采用纤维素材质，经精确的质量控制，耐受性良好。每次取样过程中应尽量使泪液收集时间和取样位点保持一致，以提高重现性。在给药后的前几次取样中，滤纸条可能会沾上眼结膜内的药液，从而导致测出的药物浓度偏高。

    2.4.2毛细管法

   　 毛细管法采用精密的定量玻璃毛细管采取泪液。取样时，毛细管轻轻接触下眼睑缘泪三角区域，泪液即通过毛细作用进入管内，吸满后移开毛细管，吹出，并用溶剂洗涤毛细管，洗出液与吹出液合并。取样时毛细管的豁口应避免接触到给药系统或其他眼组织，并准确记录取样体积。

  　  Stella等采用此法考察了阿昔洛韦前药非聚合物纳米组合物(nonpolymeric nanoassemblies)在泪液中的残留量和在眼部的透过率。兔眼部给药后在合适的时间间隔内，用毛细管收集泪液，经流动相稀释后以HPLC法分析药物浓度。结果显示，前药的纳米组合物给药后阿营洛韦在泪液中的浓度是直接给予游离阿昔洛韦的4倍，两种剂型的AUC分别为(11.78士2.06)和(2.97士0.34) mg·ml^-1.min-¹。

  　 Small等用氧氟沙星作模型药，比较了用滤纸条、毛细管和手术棉取泪液的效果。兔眼结膜囊给药后，在确定的时间点取泪液。毛细管取样时将其一端伸入兔眼结膜囊内，放置5s，尽量轻柔以减少眨眼反射，取样结束后立即称重。手术棉取样时其一端用镊子夹住，另一端轻轻伸入结膜囊内取样，一般取样时间不超过5s，完成后立即称重。滤纸条取样如前所述。样品经处理后用HPLC法分析。结果表明，用手术棉取样较快、简易、精确且易于分析，但取样量小，需十分精确的称量方法和灵敏的分析技术；毛细管和滤纸条取样精确，但毛细管法可能导致样品中的药物提取偏低，而滤纸条取样则具一定的刺激性，影响泪液流速。

    2.4.3其他方法

  　  采集泪液时还可采用其他吸收材料，如人造海绵、多孔聚酯棒和乙酸纤维素滤棒等，取样时将吸收材料一端置结膜囊内，放置一定时间。此外，可在结膜囊中滴入一定体积的盐溶液（洗眼剂），轻轻闭合眼睑，转动眼球几次，使盐溶液与泪液混合后再用毛细管取样。该法适于泪液分泌较少时的采样，但无法测定泪液的原始体积。还可用棉球擦洗法收集：取样时用棉球擦洗眼球表面的结膜表面，也可滴入少量生理盐水后，再用棉球擦洗。

    2.5非侵害性方法

   　 用非侵害性的取样方法研究眼部动力学和药物在眼部的清除，不仅减少研究中所需的动物量，允许实时检测药物浓度，还可能应用于人眼的临床研究。但其结果通常受限于检测方法对眼部各组织的分辨率及代谢产物对药物的干扰，从而影响眼部药动学讦价的准确性和灵敏度。目前用于眼部药动学研究的非侵害技术包括核磁共振技术(MR)、拉曼光谱、荧光光度测定和正电子发射断层摄影术等。

   　 Liu等采用3T磁共振成像仪¹⁹F MR检测，研究含氟药物的眼部动力学。以磷酸曲安奈德为模型药，比较了玻璃体注射和结膜下注射的动力学差异。同时在死亡动物上也进行了试验，以评估动态清除的影响。试验中采用¹H MR确定给药的位点。麻醉动物后，玻璃体或结膜下注射药物（在死亡动物的研究中，动物在给药前被处死），获取各时间点的¹⁹F光谱，得到了曲安奈德眼部的表观消除速率常数和半衰期。玻璃体和结膜下注射曲安奈德，活性动物药物眼部消除半衰期分别为8和0.5 h，死亡动物则为17和6h，活性动物药物的清除半衰期为14和0.5 h。结果表明用19F MR检测眼部含氟药物的清除具有可行性，可用于人眼部药动学的研究。

  　  La Via等用拉曼光谱仪聚焦于含两性霉素B的兔眼前房，检测房水中药物的浓度。试验中，家兔连续静脉给药Sd后，将显微镜沿视轴线聚焦在其角膜表面，随即收集到距角膜表面0.5、1和1.5 mm的拉曼特征光谱。之后立即抽取房水用HPLC分析，确认房水中药物的浓度。控曼光谱图中，由于药物光谱峰值的高度和药物的浓度呈线性相关，由此可计算出不同时间眼部的药物浓度。其结果与采用HPLC法测定的结果相似，表明用此法可预测两性霉素B在房水中的浓度，并通过相似方法可测定其他药物的眼内浓度。

3、结语

   　 一般在新药开发的前期，需详细了解药物在眼部各组织中的代谢特征及药物作用的主要靶组织时，多采用组织匀浆法。近年来可检索到的新上市药品的药动学研究大部分有组织匀浆法的相关报道，包括贝西沙星、他氟前列素、二氟泼尼酯、哌加他尼钠及酮洛酸酯等。而在新药研究的后期及仿制药的研究过程中，则可在文献基础上选择较简单方便的方法，如泪液采集法、微透析法等，尽可能节约资源、保护动物福利。

　虽然近年来眼部药动学的取样方法取得了较大的进展，但由于眼生理和解剖结构的特殊性，各方法都存在一定的局限，因此在完善已有研究方法的同时，研发更科学合理的新方法十分必要，如研究完善微渗析取样技术、非侵害技术等在体内药动学中的应用。总之，眼部药动学的取样应根据待测药物的理化特征、作用靶组织等选择合理的方法，尽可能达到连续、实时、无创和精确。

表1眼科主要疾病和治疗方案

表2近5年FDA批准的眼科新药和新制剂